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T7 gp4A protein公司正在出售的產(chǎn)品:Wistar大鼠骨髓MSC細(xì)胞Wistar大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞 神經(jīng)突觸1封閉多肽 同艾特韋病毒PCR檢測(cè)試劑盒 大鼠維生K1(VK1)試劑盒 ELISA 土壤漆活性比色法檢測(cè)試劑盒 地中海中慢生根瘤菌 轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β4抗體
更新時(shí)間:2024-01-14
商品屬性:
產(chǎn)品名稱 | 規(guī)格 | 貨號(hào) |
T7 gp4A protein | 100 ug | A-PJ1143 |
描述:
T7 gp4 蛋白來(lái)源于 T7 噬菌體,是其復(fù)制系統(tǒng)的一種核心蛋白,它既具有引發(fā)酶的作用也具有解旋酶的活性,主要應(yīng)用于全基因組擴(kuò)增(WGA),且在擴(kuò)增環(huán)狀全基因組上有非常大的優(yōu)勢(shì),常用于病毒檢測(cè)。 噬菌體T7 基因 4 編碼全長(zhǎng)產(chǎn)物 T7 gp4A 蛋白,分子量 63kD,參與噬菌體的 DNA 復(fù)制。據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道該蛋白具有 dTTP水解活性,因此具有 5’-3’解旋酶(helicase)活性。本制品為基因工程產(chǎn)物,通過重組表達(dá)純化獲得的可溶性產(chǎn)物。
儲(chǔ)存:-20℃可保存 3 年。
蛋白保存液:
20mM Tris-HCl,pH7.5
200mM NaCl
5mM DTT
25%甘油
PCR實(shí)驗(yàn)中應(yīng)該注意的問題有哪些?
沒有ct值
檢測(cè)結(jié)果遇到?jīng)]有Ct值情況,排查是否有以下問題:
1、循環(huán)數(shù)不夠(一般不超過45循環(huán),不僅背景值提高,定量也不準(zhǔn));
2、PCR程序設(shè)置錯(cuò)誤,檢測(cè)熒光信號(hào)的步驟有誤。一般SG法采用72℃延伸時(shí)采集,TaqMan法則一般在退火結(jié)束時(shí)或延伸時(shí)采集信號(hào),另外熒光采集是否選中;
3、引物或探針降解??赏ㄟ^PAGE電泳檢測(cè)引物和探針是否降解;
4、模板量可能降解或上樣量不足(不超過500ng,根據(jù)試劑盒說(shuō)明書即可), 對(duì)未知濃度的樣本應(yīng)從系列稀釋樣本的最高濃度做起;如果發(fā)生模板降解,應(yīng)考慮樣本準(zhǔn)備中雜質(zhì)的引入及反復(fù)凍融的情況,建議將模板樣本小量分裝儲(chǔ)備,避免反復(fù)凍融;
5、引物探針是否合適(尤其是引物跨越內(nèi)含子,以確保擴(kuò)增基因組DNA;上下游引物Tm值超過4℃以上也會(huì)影響擴(kuò)增)。
ct值過晚
在相對(duì)定量中, Ct值一般控制在15—25之間比較好,如果在絕對(duì)定量中, 對(duì)低拷貝數(shù)的樣品,Ct值會(huì)增大, 但是一般不宜超過40循環(huán), 否則定量不準(zhǔn)確。
因此,判斷Ct值出現(xiàn)過晚是否屬于非正常情況, 需要根據(jù)具體實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)和目的進(jìn)行。
1、擴(kuò)增效率低。引物之間或者引物和探針的比例不合適, 需要進(jìn)行優(yōu)化;引物或探針設(shè)計(jì)不合理, 需要重新設(shè)計(jì);
2、PCR程序不合適, 改用三步法進(jìn)行反應(yīng), 或者優(yōu)化退火/延伸溫度, 可以適當(dāng)降低退火溫度; 退火/延伸時(shí)間短(可以在推薦的時(shí)間條件下延長(zhǎng)10s);
3、MgCl2濃度不合適,增加鎂離子濃度等。PCR各種反應(yīng)成分的降解或加樣量的不足;
4、PCR產(chǎn)物太長(zhǎng)。PCR產(chǎn)物設(shè)計(jì)超過500bp;
5、模板中存在抑制物。用高純度模板進(jìn)行PCR檢測(cè)或?qū)⒛0暹M(jìn)行稀釋。
PCR基本步驟及注意事項(xiàng)?
一、實(shí)驗(yàn)原理
PCR是體外人工選擇性擴(kuò)增DNA的一種方法,它類似于生物體內(nèi)DNA的復(fù)制。在生物體內(nèi)DNA復(fù)制需要模板、引物、DNA聚合酶、DNA解旋酶、 dNTPs;而體外PCR反應(yīng)同樣需要類似的成分,有模板、引物、PCR Buffer、Taq酶、dNTPs。其中引物是人工設(shè)計(jì)的特定序列,實(shí)現(xiàn)對(duì)特定位置的擴(kuò)增;PCR Buffer提供一個(gè)反應(yīng)的緩沖環(huán)境;反應(yīng)過程同生物體內(nèi)一樣,DNA雙鏈打開,引物結(jié)合模板,延伸形成新鏈。而這些過程在生物體內(nèi)靠DNA解旋酶解鏈,而在體外在通過控制反應(yīng)溫度實(shí)現(xiàn)的。如常用94℃變性模板DNA打開雙鏈,在退火溫度處引物結(jié)合到模板上,最后在72℃完成延伸,并反復(fù)重復(fù)此過程即可實(shí)現(xiàn)對(duì)特定片段DNA的大量擴(kuò)增。到第三循環(huán)開始才產(chǎn)生出和靶DNA區(qū)段相同的DNA分子,進(jìn)一步循環(huán)地產(chǎn)生出靶DNA區(qū)段的指數(shù)加倍。
在擴(kuò)增后期,由于產(chǎn)物積累,使原來(lái)呈指數(shù)擴(kuò)增的反應(yīng)變成平坦的曲線,產(chǎn)物不再隨循環(huán)數(shù)而明顯上升,這稱為平臺(tái)效應(yīng)。平臺(tái)期(Plateau)會(huì)使原先由于錯(cuò)配而產(chǎn)生的低濃度非特異性產(chǎn)物繼續(xù)大量擴(kuò)增,達(dá)到較高水平。因此,應(yīng)適當(dāng)調(diào)節(jié)循環(huán)次數(shù),在平臺(tái)期前結(jié)束反應(yīng), 減少非特異性產(chǎn)物。到達(dá)平臺(tái)期(Plateau)所需循環(huán)次數(shù)取決于樣品中模板的拷貝。
二、主要的成分
1.模板可以是多種形式,主要包括基因組DNA、質(zhì)粒DNA、攜帶病毒的基因組DNA、PCR產(chǎn)物,cDNA等,但不能為RNA。對(duì)于不同類型的模板,其主要不同在于預(yù)變性的時(shí)間以及模板的量。一般對(duì)于大的基因組DNA預(yù)變性時(shí)間10min足夠,質(zhì)粒DNA2min、攜帶病毒的基因組DNA預(yù)變性2min、PCR產(chǎn)物預(yù)變性2min即可。
注意cDNA為單鏈DNA,但仍可做PCR的模板,只不過在第一輪循環(huán)時(shí)只有一個(gè)引物結(jié)合,合成另一條鏈。從第二輪開始,兩個(gè)引物均與特異位點(diǎn)結(jié)合,從而實(shí)現(xiàn)了與常規(guī)PCR的接軌。而同作為單鏈的RNA卻不能進(jìn)行PCR擴(kuò)增,原因就在于實(shí)現(xiàn)PCR反應(yīng)的是DNA聚合酶,只能特意識(shí)別DNA鏈。
2.對(duì)于模版的量來(lái)說(shuō),一般25ul體系DNA的質(zhì)量為50—100ng。對(duì)于基因組DNA由于其結(jié)構(gòu)比較復(fù)雜,提取的濃度也往往比較大,為防止?jié)舛冗^大對(duì)PCR造成影響,故需對(duì)提取的DNA進(jìn)行梯度稀釋。否則濃度過高則可能會(huì)引起非特異性擴(kuò)增。對(duì)于質(zhì)粒及PCR產(chǎn)物由于其結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單,且提取濃度一般較低,則無(wú)需稀釋。
公司正在出售的產(chǎn)品:
鵪鶉奇異線蟲染料法熒光定量PCR試劑盒 | α防御4ELISA試劑盒 NP-4免費(fèi)代測(cè)試劑 | 人腺病毒D75型探針法熒光定量PCR試劑盒 |
里氏埃里希氏體PCR檢測(cè)試劑盒價(jià)格 | 低密度脂蛋白受體相關(guān)蛋白6ELISA試劑盒 LRP6免費(fèi)代測(cè)試劑 | 肉色諾卡菌PCR檢測(cè)試劑盒供應(yīng) |
魚源性成分(Fish)核檢測(cè)試劑盒 | 胞漿免疫球蛋白ELISA試劑盒 | 綠豆內(nèi)源基因PCR檢測(cè)試劑盒 |
馬腺疫鏈球菌PCR檢測(cè)試劑盒 | 淀粉γELISA試劑盒 | 綠膿假單胞菌染料法熒光定量PCR試劑盒 |
彌散黏附性大腸桿菌(大腸埃希菌)探針法熒光定量PCR試劑盒 | 多肽-N-乙酰氨基半乳糖轉(zhuǎn)移2ELISA試劑盒 | 兔附紅細(xì)胞體探針法熒光定量PCR試劑盒 |
諾氏瘧原蟲染料法熒光定量PCR試劑盒 | 二甲基精氨二水解1ELISA試劑盒 | 結(jié)核桿菌(TB)核檢測(cè)試劑盒 |
諾卡菌通用探針法熒光定量PCR試劑盒 | 泛醌蛋白2ELISA試劑盒 | 禽皰疹病毒通用染料法熒光定量PCR試劑盒 |
蒙得維的沙門氏菌PCR檢測(cè)試劑盒 | 芳基硫酯JELISA試劑盒 | 狂犬病病毒通用探針法熒光定量RT-PCR試劑盒 |
梅毒螺旋體探針法熒光定量PCR試劑盒 | 紡錘體蛋白2BELISA試劑盒 | 破傷風(fēng)梭狀桿菌染料法熒光定量PCR試劑盒 |
牛源性成分PCR試劑盒 | 封閉蛋白17ELISA試劑盒 | 羅西奧病毒PCR檢測(cè)試劑盒 |
輪狀病毒 A 組 /B 組 /C 組核檢測(cè)試劑盒( 雙重?zé)晒?PCR 法 ) | 人成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子8(FGF8)檢測(cè)試劑盒elisa | 病毒H7亞型PCR檢測(cè)試劑盒 (熒光PCR法) |
腦心肌炎病毒(EMCV)PCR檢測(cè)試劑盒(熒光-PCR法) | 人金葡菌腸毒(SE)試劑盒ELISA | 金黃地鼠白血病病毒探針法熒光定量RT-PCR試劑盒 |
馬動(dòng)脈炎病毒染料法熒光定量RT-PCR試劑盒 | 人白介-1β前體(Pro-IL-1β)ELISA試劑盒 | 都柏林沙門氏菌探針法熒光定量PCR試劑盒 |
貓支原體PCR檢測(cè)試劑盒 | 人癌抗原27-29(CA 27-29)ELISA檢測(cè)試劑盒 | T7 gp4A protein紅斑丹毒絲菌探針法熒光定量PCR試劑盒 |
人溶菌(hLYZ)轉(zhuǎn)基因成分核檢測(cè)試劑盒 | 人7α-羥化(CYP7A)ELISA試劑盒 | 禽皰疹病毒型PCR檢測(cè)試劑盒 |