論述PCR反應(yīng)條件的控制
點(diǎn)擊次數(shù)：978 更新時(shí)間：2022-06-28
PCR反應(yīng)條件為溫度、時(shí)間和循環(huán)次數(shù)。
溫度與時(shí)間的設(shè)置：基于PCR原理三步驟而設(shè)置變性-退火-延伸三溫度點(diǎn)。在標(biāo)準(zhǔn)反應(yīng)中采用三溫度點(diǎn)法，雙鏈DNA在90～95℃變性，再迅速冷卻至40 ～60℃，引物退火并結(jié)合到靶序列上，然后快速升溫至70～75℃，在Taq DNA 聚合酶的作用下，使引物鏈沿模板延伸。對(duì)于較短靶基因（長(zhǎng)度為100～300bp時(shí)）可采用二溫度點(diǎn)法，除變性溫度外、退火與延伸溫度可合二為一，一般采用94℃變性，65℃左右退火與延伸（此溫度Taq DNA酶仍有較高的催化活性）。PCR反應(yīng)條件的控制如下：
1. PCR反應(yīng)的緩沖液提供合適的酸堿度與某些離子 。
2. 鎂離子濃度總量應(yīng)比dNTPs的濃度高，常用1.5 mmol/L。
3. 底物濃度dNTP以等摩爾濃度配制，20～200 umol/L。
4. TaqDNA聚合酶2.5U(100 ul）。
5. 引物 濃度一般為0.1 ～0.5 umol/L。
6. 反應(yīng)溫度
（1）變性溫度和時(shí)間95℃，30 s。
（2）退火溫度和時(shí)間 低于引物Tm值5 ℃左右，一般在45～55℃。
（3）延伸溫度和時(shí)間72℃，1 min/kb(10 kb內(nèi)）。
（4）Tm值=4(G+C) +2(A+T)。
7. 循環(huán)次數(shù)
一般為25 ～30次。循環(huán)數(shù)決定PCR擴(kuò)增的產(chǎn)量。模板初始濃度低，可增加循環(huán)數(shù)以便達(dá)到有效的 擴(kuò)增量。但循環(huán)數(shù)并不是可以無(wú)限增加的。一般循環(huán)數(shù)為30個(gè)左右，循環(huán)數(shù)超過30個(gè)以后，DNA聚合酶活性逐漸達(dá)到飽和，產(chǎn)物的量不再隨循環(huán)數(shù)的增加而增加，出現(xiàn)了所謂的“平臺(tái)期"。
